活體單細胞顯微技術(shù)成像可實時表征基于單細胞水平的生理變化，有助于揭示組織間的信號傳輸機制和細胞相互作用，對于預(yù)測和調(diào)控疾病進展至關(guān)重要的。然而，基于傳統(tǒng)的可見和近紅外光（NIR-I，<900 nm）顯微成像面臨嚴(yán)重的光衰減問題，活體顯微通常需要在成像部位進行手術(shù)以暴露目的組織。然而這種手術(shù)開窗輔助成像不可避免地會改變局部血管通透性，誘發(fā)皮膚、肌肉或顱骨等組織炎癥，誘發(fā)成像區(qū)域組織的微環(huán)境變化。

為此，復(fù)旦大學(xué)張凡教授研究團隊率先開發(fā)了基于近紅外第二窗口熒光（NIR-II，~1500 nm）的活體無創(chuàng)顯微技術(shù)。張凡教授最新發(fā)表的Nature Protocols論文詳細介紹了如何利用NIR-II納米熒光探針進行活體顯微成像，以避免在活體組織中的衰減，從而實現(xiàn)對深腦組織中的單細胞動態(tài)追蹤，采用光學(xué)性能優(yōu)異的稀土納米探針ErNPs和TmNPs標(biāo)記活體中的中性粒細胞，實現(xiàn)了對腦卒中小鼠腦皮層中中性粒細胞無創(chuàng)動態(tài)可視化和遷移行為分析。在這篇文章中，研究團隊詳細介紹了NIR-II顯微成像用于活體動態(tài)細胞追蹤的實驗方案（圖1），從NIR-II納米熒光探針的設(shè)計合成與表征，多通道NIR-II顯微成像設(shè)備的靈活搭建，活體標(biāo)記細胞，NIR-II活體顯微成像實驗的前期準(zhǔn)備與實時成像操作，數(shù)據(jù)分析等多方面進行了詳細的介紹。

圖1. 近紅外二區(qū)活體熒光顯微成像技術(shù)的工作示意圖

其中，團隊利用開發(fā)的新型近紅外二區(qū)稀土熒光探針特異性的標(biāo)記了小鼠的中性粒細胞以研究炎癥血管中活化中性粒細胞的體內(nèi)成像（圖2）。中性粒細胞能夠在血管內(nèi)壁爬行到外滲部位，然后外滲是中性粒細胞活化的典型特征。CD11b是一種介導(dǎo)細胞粘附和遷移的中性粒細胞表面蛋白，在活化的中性粒細胞表面表達上調(diào)。中性粒細胞上Ly6G和CD11b蛋白的雙重標(biāo)記有助于在體內(nèi)特異性地跟蹤活化的中性粒細胞。因此，在缺血性腦卒中小鼠模型中，靜脈注射抗ly6g抗體偶聯(lián)的α-TmNPs和抗cd11b抗體偶聯(lián)的α-ErNPs (α-Er-aCD11b)，標(biāo)記活化的中性粒細胞，雙標(biāo)記的中性粒細胞表現(xiàn)出微弱的運動、滾動和爬行，表明它們在內(nèi)皮細胞表面粘附牢固。此外，可以觀察到雙標(biāo)記的中性粒細胞，沿著血流的剪切力被拉長，這通常被認為是中性粒細胞通過炎癥血管外滲的最后一步。

圖2. 炎癥血管中活化中性粒細胞的體內(nèi)成像。

最后，本文對基于NIR-II熒光活體顯微設(shè)備和技術(shù)的適用范圍和應(yīng)用前景進行了總結(jié)與展望，致力于將NIR-II熒光顯微技術(shù)推廣于腦科學(xué)、感染科學(xué)、免疫與炎癥、腫瘤、干細胞等生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的基礎(chǔ)研究應(yīng)用中。

參考文獻

Ying Chen, Yiwei Yang, and Fan Zhang*. Noninvasive In Vivo Microscopy of Single Neutrophils In The Mouse Brain Via NIR-II Fluorescent Nanomaterials. Nature Protocols, 2024. DOI: doi.org/10.1038/s41596-024-00983-3.